温度对青花菜小孢子胚胎发生的影响及机理研究

【摘要】青花菜（Brassicaoleracea.L.var.italica)属于十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，异花授粉植物，杂交育种是其主要的育种方式。为获得稳定遗传的高代自交系，通常需要6-8代的连续蕾期自交。通过游离小孢子培养技术，在2年内可获得纯合的自交系材料，缩短了育种年限，加快了育种进程。小孢子出胚情况受基因型、温度预处理及植株生长状况等内外因素的影响，从而限制了游离小孢子培养技术在育种工作中的广泛应用。研究小孢子胚胎发生的途径、不同温度预处理条件下小孢子的出胚率和胚胎发生的分子机理，对加快小孢子培养技术在育种的应用进程，提高育种效率，具有重要理论意义和应用价值。本研究以青花菜B908（易出胚）和B1092（不易出胚）为实验材料，通过显微观察、qPCR、RACE以及转录组测序等方法，从细胞和分子两个层次对温度对小孢子胚胎发生的影响和机理进行了研究，获得主要研究结果如下：1．4℃、32.5℃、4℃+32.5℃（组合处理）等不同温度预处理条件下，小孢子胚胎发生途径基本相同，均以对称分裂产生胚胎的孢子体发育途径为主（B途径），经历球型胚、心型胚、鱼雷胚，最终形成子叶型胚状体。但不同温度预处理条件下，小孢子启动胚胎发生的频率不同，从成胚率来看，4℃+32.5℃组合处理后的成胚率最高。2．TDF4、TDF9、TDF19、TDF20、TDF25与BBM基因在不同温度预处理条件下，小孢子胚胎发生早期不同发育阶段的表达模式不同，TDF19的表达模式与BBM基因相似，在32.5℃高温及4℃+32.5℃4组合处理后表达量升高，两者相关系数为0.76。3．克隆获得了一个与青花菜小孢子胚胎发生相关的基因（TDF19)，该基因全长为2283bp，编码760个氨基酸，预测等电点为6.11，分子量为85.5KD。预测该基因二级结构中包含了-螺旋，-转角，无规则卷曲等结构，预测三级结构中包含3个结构模块，其中第一个结构中包含2个Zn结合位点，通过序列分析，推测该基因的编码蛋白属于蛋白激酶。4．对25℃（对照）、4℃、32.5℃、4℃+32.5℃（组合处理）不同温度预处理下的4个样品进行转录组测序，分别获得了56784407、52339892、68744711、73345307条高质量reads；通过将不同处理与对照样品比较，结果显示4℃低温预处理与对照间表达差异显著的isoform有31个，32.5℃高温处理与对照间表达显著差异的isoform有1281个，4℃+32.5℃组合处理与对照处理间的表达差异显著的isoform有1673个。5．通过KEGG代谢通路富集分析，32.5℃及4℃+32.5℃组合处理样品与对照相比，富集了可能与小孢子胚胎发生密切相关的包含了信号转导及细胞内信号传导、次生代谢产物的合成和代谢、水杨酸和茉莉酸等的刺激反应、脱落酸的信号传导等代谢途径。
【作者】孙继峰；
【导师】刘玉梅；
【作者基本信息】中国农业科学院，蔬菜学，2014，博士
【关键词】青花菜；胚胎发生；RACE；基因克隆；转录组；

【参考文献】
[1]李鹏.应用iTRAQ-LC-MALDI-MS/MS技术分析胸科手术患者单肺通气后血清的差异蛋白质[D].广西医科大学,麻醉学（专业学位）,2013,硕士.
[2]丁国声.论经济全球化背景下的中国国家经济安全[D].吉林大学,国际政治,2004,硕士.
[3]黄晓霞.螺杆马达（PDM）流—固耦合动态仿真[D].华中科技大学,固体力学,2013,硕士.
[4]强宇,刘宗田,林炜,时百胜,李云.模糊概念格在知识发现的应用及一种构造算法[J].电子学报,2005,02:350-353.
[5]胡玉强,陈振.关于水利水电工程造价控制与管理的几点思考[J].水利规划设计.2001(01)
[6]张岩.考虑自热效应互连性能优化及硅通孔结构热传输分析[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2013,博士.
[7]尤金朋.基于语义分析的文本相似度算法研究[D].杭州电子科技大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[8]柳柏杨.二氧化硅纳米粒子/碳纳米管杂化纳米增强体的制备及其对CFRP增强效应的研究[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[9]姜旭平.慢性心理应激促进PANC-1荷瘤裸鼠移植瘤发生、发展机制的研究[D].青岛大学,病理学与病理生理学,2013,硕士.
[10]徐东昊.在篮球教学课中对中小学生实施德育教育的研究[D].吉林体育学院,体育教育理论与实践,2013,硕士.
[11]李晓梅.红细胞刺激因子在癌性贫血中应用的meta分析及血细胞自动识别与病理分析[D].山东大学,临床医学（专业学位）,2014,博士.
[12]高金亮.青海血蜱cDNA表达文库的构建和“隐藏抗原”基因的筛选、克隆与表达[D].中国农业科学院,预防兽医学,2004,硕士.
[13]彭享生,黎明.濮城复式油气田的勘探历程[J].石油地球物理勘探,1988,01:90-101+130.
[14]朱姗.〈万历野获编〉的史料来源与“小说家笔法”研究[D].北京大学,中国古代文学,2013,硕士.
[15]赵悦.《乐府传声》及其在现行声乐艺术中的借鉴研究[D].西安音乐学院,声乐教学与演唱,2014,硕士.
[16]田慧.山西省民营企业发展问题研究[D].山西财经大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[17]陈松乔.微型计算机中西文表格自动处理技术[J].冶金自动化,1986,05:46-49+63.
[18]焦瑾.基于数据挖掘的商业银行个人客户细分系统分析与设计[D].西南财经大学,2003.
[19]韩杰.鞘内注射地佐辛对急性痛模型大鼠镇痛作用的影响[D].兰州大学,麻醉学,2013,硕士.
[20]胡吉伟.电热丝切割机的开发与研究[D].华东理工大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[21]王伟.轨道不平顺对地铁车辆动力学性能的影响分析[D].西南交通大学,车辆工程,2014,硕士.
[22]陆锡明,朱浩.上海市客运换乘枢纽的研究[J].上海建设科技.1998(02)
[23]郑小璇.中澳项目县/市农村6～24月龄儿童贫血状况及其影响因素分析[D].华中科技大学,公共卫生,2013,硕士.
[24]王自正.钢绳牵引胶带输送机的几项改进[J].煤炭科学技术.1983(02)
[25]李惠琴.数据仓库技术在超市决策支持中的应用[J].楚雄师范学院学报,2003,03:17-18+24.
[26]徐德华.教学研究起点的反思与重构[D].浙江师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[27]童杨帆.大陆微电影发展现状与产业化路径探析[D].西南交通大学,艺术学,2014,硕士.
[28]周晴.浅析学校社会工作介入退役士兵职业技能教育培训工作的应用[D].华中师范大学,社会工作,2013,硕士.
[29]李艳.高校图书馆知识社区构建研究[D].黑龙江大学,图书馆学,2013,硕士.
[30]李建武.《封神演义》创作思想探究[D].陕西师范大学,中国古代文学,2004,硕士.
[31]盛稳稳.间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25在家蚕杆状病毒系统中的表达研究[D].浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[32]李立.调谐液体阻尼器（TLD）对高层结构抗震性能的影响研究[D].西安建筑科技大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[33]李佩杰,韦化,李滨,阳育德.最优潮流中有向无环图的并行数值分解算法[J].电力系统自动化,2012,19:66-72.
[34]徐健.D物流公司LNG业务拓展战略研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[35]李贺.MMPs抑制剂对牙本质粘结混合层胶原纤维影响的形态学观察[D].吉林大学,口腔医学,2013,硕士.
[36]赵丽.VGCF填充聚合物体系的结构、导电性与流变行为研究[D].浙江大学,2011.
[37]金妮.公司资本制度模式研究[D].吉林大学,法律,2004,硕士.
[38]张峰.一类修正二元Camassa-Holm方程组的整体守恒解[D].西南交通大学,基础数学,2014,硕士.
[39]孟笑红.以课题研究为抓手,探索中等职业教育教学方法[J].中国校外教育.
[40]李颖.我国反家庭暴力立法探究[D].安徽大学,法律,2013,硕士.
[41]漆贺同.新型纳米复合膜材料的制备及其电化学性能研究[D].西北师范大学,2012.
[42]马莲.天津市古文化街旅游商贸区的战略发展研究[D].天津师范大学,2004.
[43]李彦成.量子可逆逻辑电路的设计及优化[D].华东交通大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[44]李英.我国城市商业银行内部信用风险评级研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[45]余运江.单相光伏并网逆变器的研究[D].浙江大学,2008.
[46]孙生生.金刚石纳米锥与Cu-TCNQ纳米线的光电特性研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2013,硕士.
[47]陈俊,颜伟,卢建刚,李世明,李钦,赵雪骞.考虑多时段量测随机误差的变压器参数抗差估计方法[J].电力系统自动化,2011,02:28-33.
[48]史一剑.考虑微观GTN损伤模型的建筑钢材力学性能研究[D].北京交通大学,2013.
[49]许少峰.我国优秀女子曲棍球运动员短角球技术研究[D].吉林大学,运动人体科学,2014,硕士.
[50]本刊编辑部.正确认识断层正确解释断层[J].石油地球物理勘探,1972,06:1-9.